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    抗體純化推薦使用的方法

    發布時間: 2016-05-12  點擊次數: 1034次

       純化抗體通常用于直接檢測抗原。此時抗體標記有一個鑒定的標記物,用于結合和檢測所研究的抗原。在間接檢測抗原方法中,一抗不被標記,而是用標記的二抗(一種抗免疫球蛋白抗體)來檢測。一般而言,建議使用間接法。因為許多商家能夠提供可靠的標記二抗,用間接法不僅省力,結果同樣可靠。
       盡管如此,有幾種方法需要標記的一級抗體。例如,在免疫染色試驗中,需要研究2個或2個以上抗原的相對位置時,常需要純化抗體并用不同標記物標記,這樣能比較它們的相對位置。此時使用間接法不合適。因為間接法是用標記二抗來給未標記的一抗定位。又如,有時一抗需要標記,而該樣本中又有大量無關抗體,它們能干擾對一抗的檢測,此時用間接法也不合適。用鼠源性單抗對鼠組織抗原進行定位時,也會出現這種情況。此時需要純化一抗,并直接按下述方法進行標記。
       免疫親和純化是另一種可能需要純化抗體的技術。在這一技術中,抗體共價交聯到一固相基質上,如交連的瓊脂糖或聚丙烯酰胺微球。常用的方法是,先將抗體純化,然后連接到通過化學方法激活而具有結合位點的微球上。此時,抗體的純化對實驗的成功至關重要。
    還有一種需要純化抗體的試驗,是從多克隆抗血清中分離抗原特異性抗體。多克隆血清中含有復雜多樣的抗體,它不僅含有針對免疫原產生的抗體,還有血清的全部抗體。出于特定目的的需要,必須將抗原的特異性抗體分離出來。例如使用抗肽抗體時,需要分離出特異性識別肽段的抗體。通過純化能獲得特異性很高的抗體。純化抗體的另一用途是降低本底。幾乎在所有技術中,使用純化抗體都能降低非特異性本底。產生這種效果主要是因為一方面能去除引起實驗誤差的污染蛋白,另一方面能控制實驗中產生陽性信號的抗體量。使用純化抗體不會使本底增加,因此純化抗體可以作為所有免疫化學實驗中降低本底的基本手段。
    抗體的純化通常是濃縮抗體的zui簡單方法。任何來源的抗體可以用蛋白A或蛋白G的純化方法來濃縮。
        盡管純化抗體的方法較多,建議用蛋白A或蛋白G微球純化法作為zui常用的方法。這種方法效率高,能為常用的實驗方法提供足夠純化的抗體,而且隨著商品化的蛋白A和蛋白G基質的出現,能將任何來源的抗體純化??贵w的純化也可采用傳統的色譜法,在某些情況下非常有用。這些方法包括DEAE離子交換色譜法、硫酸銨沉淀法及其他方法。但是用蛋白G或蛋白A親和柱法純化較其他方法簡單,并且純化效果是其他方法的數倍。因此在所有方法中,我們推薦這種方法。
       有一種情況不適于應用蛋白G或蛋白A親和柱純化抗體,即多克隆抗體需要進一步分離,且針對某種特異性抗原的組分需要分離。此時可用抗原結合的親和柱純化抗原特異性抗體。

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